Kisspeptiinon väikese molekuliga peptiid, mis koosneb 54 aminohappejäägist molekulmassiga ligikaudu 6000 daltonit. Selle aminohappejärjestus on imetajatel väga konserveerunud, mis tähendab, et sellel on erinevates liikides sarnased struktuurid. Inimestel on kisspeptiini aminohappejärjestus H-Phe Gly Gly Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Eu Ser Arg Al Glu Eu Ser Arg. Kiss1 geeni poolt kodeeritud geen transkribeeritakse esmalt Kiss1 valgu prekursoriks, mis läbib rea töötlust ja splaissimist, et lõpuks moodustada küps kisspeptiin. Kisspeptiini lagunemine toimub peamiselt peptidaaside kaudu, mis lagundavad selle väiksemateks fragmentideks või üksikuteks aminohapeteks. Mängib reproduktiivsüsteemis olulist rolli. Seda peetakse oluliseks gonadotropiini vabastavat hormooni (GnRH) vabastavaks faktoriks, mis võib stimuleerida gonadotropiinide vabanemist, soodustades seeläbi sugurakkude küpsemist ja ovulatsiooni. Lisaks osaleb kisspeptiin ka teiste füsioloogiliste protsesside, näiteks emotsioonide, mälu ja kognitiivse funktsiooni reguleerimises.
Kisspeptiinpeptiid, tuntud ka kui Kiss1 peptiid või RFRP-1 peptiid, on inimkehas leiduv neuropeptiid. Laboris kasutatakse Kisspeptiini sünteesimiseks tavaliselt järgmisi sünteesimeetodeid:
Keemiline süntees:
Keemiline süntees on kõige sagedamini kasutatav meetod kisspeptiini sünteesimiseks laboris. See meetod hõlmab mitmeid keemilisi reaktsioone, nagu kondensatsioon, kaitse eemaldamine ja magestamine. Nende hulgas on võtmeetapp peptiidsidemete moodustamine aminohapete vahel, kasutades tavaliselt klassikalisi sidestusaineid, nagu EDC (1-etüül-3- (3-dimetüülaminopropüül) - karbodiimiid) või BOP ( bensotriasool-1-üüloksü-tris(dimetüülamino)fosfooniumheksafluorofosfaat). Keemilise sünteesi eeliseks on see, et sellega saab saada kõrge puhtusastmega kisspeptiini, kuid selle meetodi puuduseks on see, et see nõuab tülikaid katseetappe ja rangeid laboritingimusi, samas kui saagis on madal.
Konkreetsed reaktsioonietapid on järgmised:
1. Valmistage ette lähtematerjalid. See hõlmab vajalikke aminohappeid, aktivaatoreid (nagu EDC või BOP), kaitse eemaldamise reaktiive (nt trifluoroäädikhape või vesinikbromiidhape), aga ka muid vajalikke reaktiive ja puhverlahuseid.
2. Veevabades ja hapnikuvabades tingimustes lahustage vajalikud aminohapped sobivates lahustites, nagu dimetüülformamiid (DMF) või N,N-dimetüülatseetamiid (DMA).
3. Lisage vajalik aktivaator (nagu EDC või BOP) ja segage peptiidsidemete moodustumiseks toatemperatuuril teatud aja jooksul.
4. Lisage moodustunud peptiidsidemetele kaitset eemaldavaid reaktiive (nagu trifluoroäädikhape või vesinikbromiidhape), et eemaldada aminokaitserühmad.
5. Lisage vajalikud kaitserühmad (nagu Boc või Fmoc), et kaitsta äsja moodustunud aminorühmi.
6. Korrake ülaltoodud samme, kuni kõik vajalikud aminohapped on ühendatud.
7. Lisage peptiidahelale vajalikud kõrvalahela modifikatsioonid ja/või markerid.
8. Lõpuks viidi läbi kaitse eemaldamise reaktsioon, et eemaldada kõik kaitserühmad ja saada puhastatud kisspeptiin.
Ülaltoodud on põhiline keemilise sünteesi meetod ja konkreetsed etapid võivad erineda sõltuvalt konkreetsest Kisspeptiini järjestusest ja vajalikest modifikatsioonidest. Kogu sünteesiprotsessi ajal on vaja rangelt kontrollida katsetingimusi, sealhulgas lahustit, temperatuuri, pH-d, aega ja rõhku, et tagada reaktsiooni sujuv kulgemine ja toote kõrge puhtus. Samal ajal tuleb pöörata tähelepanu keemiliste reaktsioonide ohutusele ning vältida ohtlike reaktiivide ja toimingute kasutamist.
Geenitehnoloogia süntees:
Geenitehnoloogia süntees on tõhus, kiire ja ökonoomne meetod kisspeptiini sünteesiks. See meetod kasutab geenitehnoloogia tehnoloogiat Kisspeptiini prekursorvalgu ekspresseerimiseks mikroorganismides, nagu Escherichia coli või pärm, ning seejärel läbib järeltöötluse küpse kisspeptiini saamiseks.
Järgmine on lihtsustatud protsess:
1. Geeni kloonimine: Esiteks on vaja hankida kisspeptiini geenijärjestus. Seda saab bioloogilistest kudedest saada RT PCR, genoomi sekveneerimise või muude geenide kloonimise tehnikate abil.
2. Vektori valik: järgmiseks peate valima vektori, et asetada Kisspeptini geenijärjestus. See on tavaliselt kahjutu bakteriaalne plasmiid või viirusvektor. Vektor on loodud Kisspeptin geeni sisestamiseks ja selle rakku toomiseks.
3. Geeni transformatsioon: sisestage Kisspeptin geen vektorisse ja seejärel viige see kompleks (geen+vektor) üle insenerbakteritesse, nagu Escherichia coli või pärm.
4. Ekspressioon: insenerbakterites "loetakse" Kisspeptini geen ja see juhib valgusünteesi. Tavaliselt kinnitatakse need valgud järgnevate puhastusprotsesside jaoks spetsiaalsetele keemilistele märgistele.
5. Järeltöötlemine: neid konstrueeritud bakterite poolt toodetud kisspeptiini prekursorvalke saab koguda ja puhastada selliste etappide kaudu nagu rakkude fragmenteerimine, tsentrifuugimine ja dialüüs.
Selle meetodi eeliseks on see, et sellega saab lühikese aja jooksul toota suures koguses kisspeptiini ja selle maksumus on suhteliselt madal. Lisaks on sellel tootmismeetodil mikroorganismide kasutamise tõttu minimaalne mõju keskkonnale. Selle meetodi puuduseks on aga see, et see nõuab mikroorganismidega manipuleerimist ja seetõttu on vaja teatud laborivarustust ja -oskusi.
Bioensümaatiline hüdrolüüs:
Bioensümaatiline hüdrolüüs on kisspeptiini sünteesimise meetod ensüümkatalüüsi abil. See meetod kasutab spetsiifilisi bioloogilisi ensüüme, et muuta Kisspeptiini prekursorvalgud küpseks kisspeptiiniks.
Kisspeptiini sünteesimise põhietapid bioloogilise ensümaatilise hüdrolüüsi teel:
1. Geeni kloonimine ja vektori valik: Esiteks on ikkagi vaja hankida Kisspeptiini geenijärjestus ja seejärel valida vektor selle sisestamiseks.
2. Ekspressioon: sisestage vektorisse Kisspeptin geen ja seejärel viige see kompleks (geen+vektor) konstrueerimisbakterisse.
3. Valgu süntees: insenerbakterites "loetakse" Kisspeptini geen ja see juhib valgusünteesi. Need valgud on tavaliselt kinnitatud spetsiaalsete keemiliste etikettide külge.
4. Bioensümaatiline hüdrolüüs: spetsiifiliste proteaaside, nagu subtilisiin või trüpsiin, kasutamine prekursorvalkude muundamiseks küpseks kisspeptiiniks. Bioloogilistel ensüümidel on kõrge spetsiifilisus ja katalüütiline efektiivsus, nii et selle reaktsioonietapi saab kiiresti ja tõhusalt lõpule viia.
5. Järeltöötlemine: Kisspeptiin kogutakse lõpuks kokku ja puhastatakse läbi mitmete etappide, nagu rakkude fragmenteerimine, tsentrifuugimine, dialüüs jne.
Selle meetodi eeliseks on see, et see suudab lühikese aja jooksul lõpule viia Kisspeptiini sünteesi. Mitte ainult sünteesikiirus pole kiire, vaid ka bioloogiliste ensüümide katalüütiline efektiivsus on äärmiselt kõrge, mis võib oluliselt parandada sihtvalkude saagist. Samal ajal on ensümaatilises hüdrolüüsis kasutatavad bioloogilised ensüümid sageli kõrge spetsiifilisusega ja võivad täpselt ja tõhusalt funktsioneerida keerulistes bioloogilistes molekulides. Seetõttu on see meetod keskkonnasõbralik ja sellel on sihtvalgu struktuuri ja funktsiooni vähemõju. Sellel meetodil on aga ka teatud piirangud, nagu raskused bioloogiliste ensüümide hankimisel ja valmistamisel, kõrged kulud ja vajadus reaktsioonitingimuste täpseks juhtimiseks.
Rakukultuur:
Rakukultuur on meetod Kisspeptiini sünteesimiseks laboris. See meetod hõlmab kisspeptiini geenijärjestust sisaldava rakuliini kultiveerimist ja seejärel sekreteeritud kisspeptiini kogumist kultiveerimissöötmest. Täpsemalt, Kisspeptiini geenijärjestus sisestatakse esmalt rakuliini, millele järgneb rakukultuur ja seisundi optimeerimine. Lõpuks kogutakse söötmest kisspeptiin. Rakukultuuri eeliseks on see, et see suudab toota suures koguses kisspeptiini ja selle meetodi kasutamine on suhteliselt lihtne.
Kokkuvõtteks võib öelda, et Kisspeptiini sünteesimiseks laboris on erinevaid meetodeid ning igal meetodil on oma eelised ja puudused. Sünteesiks saab valida sobivad meetodid vastavalt tegelikele vajadustele. Nende hulgas on keemiline süntees ja geenitehnoloogia süntees kõige sagedamini kasutatavad meetodid, samas kui ensümaatiline hüdrolüüs ja rakukultuur on muud teostatavad võimalused.