GLP-1(link:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptid-cas-87805-34-3.html) on polüpeptiidhormoon, mis koosneb 30 aminohappest. GLP{2}} põhjaliku uurimistööga on välja töötatud üha rohkem sünteetilisi meetodeid. See artikkel tutvustab süstemaatiliselt praegu teadaolevaid GLP-1 sünteesimeetodeid.
Meetod 1, tahkefaasiline süntees:
Tahkefaasiline süntees on peptiidide ja valkude sünteesiks laialdaselt kasutatav meetod ning seda kasutatakse sageli ka GLP-1 sünteesiks. Tahkefaasilise sünteesi korral moodustub tuumastruktuur esimese aminohappe sidumisel vaiguga. Järgmisena lisatakse järjestikku järgmine aminohape ja lastakse keemiliselt reageerida sobiva kondenseeriva ainega. Lõpuks võib sihtsaaduse saada polüpeptiidi vaigu küljest lõikamisega.
Tahkefaasilise sünteesi tähtsus seisneb selles, et see võimaldab peptiidide sünteesi automatiseerimist ja suuremahulist tootmist. Praeguste tahkefaasiliste sünteesimeetodite hulka kuuluvad Fmoc ja Boc. Nende hulgas kasutab Fmoc meetod peptiidi kaitsmiseks N-Fmoc kaitserühma, Boc meetod aga tert-butüüloksükarbonüüli karboksüülrühma kaitsmiseks.
Teine meetod, vedelfaasi süntees:
Vedelfaasi süntees on peptiidide sünteesi traditsiooniline meetod, mille puhul reagendid asetatakse reaktsiooni jaoks vedelasse faasi. Vedelfaasilise sünteesi eeliseks on see, et reaktsioonitingimused on leebed ja sobivad tundlike keemiliste struktuuride muutmiseks. Liiga paljude reagentide tõttu on puhastusprotsess aga suhteliselt tülikas. Vedelfaasilise sünteesi keemilised reaktsioonid hõlmavad:
1. Kondensatsioonireaktsioon:
Kondensatsioonireaktsioon on peptiidide sünteesi üks põhilisi reaktsioone, see tähendab, et kondenseerivate ainete, nagu DCC ja HOBt, poolt algatatud karboksüülrühm ühendatakse atsüülimisreaktsiooni kaudu aminohappe aminorühmaga. Reaktsioonitingimused on leebed ja saagis kõrge.
2. Eliminatsioonireaktsioonid:
Eliminatsioonireaktsiooniks on metioniini redutseerimine ditiooliks NaBH4 ja teiste redutseerivate ainete abil, muutes selle inaktiivseks. Reaktsioon tuleb läbi viia aluselistes tingimustes.
3. Kaitserühmade eemaldamine:
Tänu aminohapete erinevatele funktsioonidele peptiidahelas kasutatakse kaitseks erinevaid kaitserühmi. Pärast sünteesi lõppu tuleb kaitserühm eemaldada. Fmoc meetodi puhul kasutatakse Fmoc eemaldamiseks tavaliselt piperidiini; samas kui Boc-meetodi puhul kasutatakse Boc eemaldamiseks TFA-d.
Kolmas meetod, keemiline süntees:
GLP{0}} on olulise bioloogilise aktiivsusega polüpeptiidhormoon. Selle sünteesi saab teostada erinevate meetoditega, mille hulgas on keemiline süntees üks enamkasutatavaid meetodeid. Keemilise sünteesi eeliseks on see, et sellega saab toota väga puhtaid sihttooteid, mis sobivad suuremahuliseks tootmiseks. Allpool tutvustatakse GLP-1 keemilise sünteesi meetodit ja üksikasjalikke samme.
1. Sünteesitee ja kaitserühma valik:
GLP-1 molekul koosneb 36 aminohappest, sealhulgas 21 L-tüüpi ja 15 D-tüüpi aminohapet. Enne sünteesi läbiviimist on vaja valida sobiv sünteesitee ja valida vastav kaitserühm vastavalt sünteesitingimustele. Fmoc tahkefaasilist sünteesi kasutatakse tavaliselt automatiseeritud suuremahuliseks sünteesiks. See meetod kasutab kaitserühmana N-9-fluoroimidokarboksüülkaitset (N-Fmoc) ja konkreetsete kohtade kaitse tagamiseks tuleb valida ka sobiv sekundaarne kaitserühm (nagu tert-butüül- või metüülrühm). Iga kord, kui lisatakse uus aminohape, tuleb kõigepealt eemaldada Fmoc kaitserühm ja seejärel lisada järgmise aminohappe kaitstud sidestusaine.
2. Põhiaminohappejärjestuse süntees:
GLP-1 põhijärjestus koosneb 21 aminohappest, sealhulgas võtmeseriinist ja neljast prolüülglutamiinhappe dipeptiidi järjestusest. Tahkefaasilise sünteesi korral võib põhijärjestuse sünteesi jagada järgmisteks etappideks:
2.1. Lisage tahkefaasilisele sünteetilisele vaigule äädikhappe karbamaat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) ja 2-Cl-Trt-Cl ning viige läbi kondensatsioonireaktsioon DIC/NMM sidestusainega.
2.2. Eemaldage Fmoc kaitserühm deprotekteerimisrühma reaktsiooniga.
2.3. Lisage järgmine aminohape, korrake etappe 1 ja 2 järjestikku, kuni põhijärjestus on sünteesitud.
2.4. Pentapeptiidstruktuuride moodustumine tahkefaasilisel vaigul. Lisage tahkefaasilisele vaigule atsetaliseerimisreaktiiv, reageerige N-otsa tuvastusainega (nt HBTU), lisage redutseeriva abiainena seriini külgahela kaitserühm ja eemaldage seejärel Fmoc-kaitserühm.
2.5. Bacillus subtilis'e transferaasi (ProTide) katalüüsil läbib pentapeptiidi struktuur vahetusreaktsiooni seriinjodoatsetaadi prekursoriga.
3. Ülejäänud aminohappejärjestuse süntees:
Pärast põhijärjestuse sünteesi lõpetamist on vaja jätkata ülejäänud aminohapete, sealhulgas L- ja D-tüüpi aminohapete lisamist. Nende aminohapete lisamist tuleb alustada põhijärjestusest, lisada järjestuses järgmine aminohape ja kasutada vastavat kondenseerivat ainet keemiliste reaktsioonide läbiviimiseks kuni täieliku GLP-1 polüpeptiidi molekuli sünteesimiseni. Selle protsessi käigus on samuti vaja vastavalt vajadusele valida sobiv kaitserühm ning viia läbi reaktsiooni, kaitserühma eemaldamise ja aminohappe lisamise etapid.
4. Naatriumhüdroksiidiga töötlemine:
Pärast kõigi aminohapete lisamist moodustub tahkefaasilisele vaigul mittetäielikult sünteesitud peptiidahel, mida tuleb töödelda täielikult moodustunud peptiidi molekuli moodustamiseks. Esiteks tuleks moodustamata peptiid hüdrolüüsida naatriumhüdroksiidiga, nii et C-terminaalne karboksüülrühm, mis oli algselt vaiguga seotud, eraldub vaigust ja kaitserühm eemaldatakse vees. Pärast hüdrolüüsireaktsiooni saadakse sihtsaadus.
5. Sadestamine ja pesemine:
Pärast töötlemist töödeldakse hüdrolüüsitud lahust sihtprodukti sadestamiseks happega. Järgmisena suspendeeriti pellet uuesti vees, millele järgnes intensiivne pesemine lisandite eemaldamiseks.
6. Puhastamine:
Viimane etapp on soovitud produkti puhastamine, kasutades tavaliselt kõrgsurvevedelikkromatograafiat. Selle protsessi käigus saab toote puhtust määrata massispektri lahuse piigi tuvastamisega. Lühidalt öeldes nõuab GLP{0}} keemiline süntees mitut keeruliste reaktsioonide vooru ja rangeid puhastusprotsesse, et lõpuks saada aktiivne sihtsaadus.
Neljas meetod, biosüntees:
GLP-1 on oluline polüpeptiidhormoon, millel on erinevad füsioloogilised toimed, sealhulgas insuliini sekretsiooni soodustamine, söögiisu pärssimine, kehakaalu vähendamine ja insuliinitundlikkuse säilitamine jne. GLP-1 biosünteesi meetodit sünteesivad peamiselt L-rakud. kõhunäärmes ja selle sünteesi kiirust reguleeritakse toiduga. Üksikasjalikud sammud tutvustatakse järgmiselt:
1. Ettevalmistustöö enne sünteesi:
Enne GLP{0}} biosünteesi tuleb teha mõned ettevalmistustööd, sealhulgas määrata kasutatud rakutüüp, määrata kultiveerimistingimused ja valida sobiv katalüütiline ensüüm. L-rakud on GLP-1 sünteesi peamine allikas, kuna need sisaldavad kahe hormooni, GIP (glükagoonilaadne peptiid 1) ja GLP-1 prekursoreid. L-rakke saab eraldada küülikute või hiirte sooleepiteelist. Enne biosünteesi tuleb rakke piisaval hulgal kasvatada ning tagada piisav hulk toitaineid ja sobivad kultiveerimistingimused. Lisaks on reaktsiooni soodustamiseks vaja valida sobiv katalüütiline ensüüm.
2. Lähteainete süntees ja töötlemine:
GLP{0}} biosüntees toimub peamiselt L-rakkudes ja selle prekursor koosneb kahest hormoonist GIP ja GLP-1. Pärast sisesekretsioonirakkudesse sisenemist töödeldakse GIP ja GLP-1 proteolüütiliste ensüümide poolt ning lõhustatakse üksikuteks peptiidideks. Selles protsessis osalevad mitmed ensüümid ja kofaktorid, sealhulgas polüpeptiidhappe prekursor (PC2), isomeraas ja hilised adhesioonifaktorid.
3. Polüpeptiidi segmentide vastastikune muundamine:
Pärast töötlemist rekombineeritakse GIP ja GLP{0}} peptiidid, moodustades GLP-1 polüpeptiidi. See protsess nõuab glükagoonitaolise peptiidi 1 (GLP-1) kasutamist matriitsina, mille külge kombineeritakse teised üksikud peptiidid, et moodustada uued liitpolüpeptiidid. See protsess nõuab ka teatud spetsiifilisi ensüüme ja tegureid, sealhulgas prohormoonkonvertaas 1/3 (PC1/3) ja karboksüpeptidaas E (CPE).
4. GLP-1 sekretsioon:
Pärast GLP-1 sünteesimist ja töötlemist talletatakse seda endokriinsete rakkude tsütoplasmas ja sisemistes vesiikulites. Dieedi stimuleerimisel vabastavad endokriinrakud GLP-1 ja sisenevad vereringesse mikroveresoonte kaudu. Seda protsessi reguleeritakse ja juhitakse mitmete signaaliülekanderadade, sealhulgas cAMP-Ca kaudu2 plussja nii edasi.
Lühidalt, GLP{0}} biosüntees hõlmab mitme lingi ja teguri ühistegevust. Biosünteesi ja keemilise sünteesi kombinatsioon võib anda parema aluse ja toe GLP uurimisele ja tootmisele-1.
Viies meetod, ensümaatiline süntees:
Ensümaatiline süntees on peptiidahelate süntees bioloogiliste ensüümide katalüüsi kaudu. Võrreldes traditsiooniliste vedelfaasi sünteesimeetoditega saab ensümaatilist sünteesi läbi viia toatemperatuuril ja valida saab laias valikus tooraineid. Sünteesi katalüüsimiseks kasutatakse tavaliselt ensüüme nagu teeta-vedelik süntaas, AEP, ACE jne.
Kokkuvõtteks võib öelda, et ülalmainitud meetodid on GLP{1}} sünteesiks teostatavad meetodid. Erinevates katsetingimustes ja ravimite tootmiskeskkondades sobivad erinevad meetodid.